TFIIF是一種由兩個(gè)保守亞基組成的通用轉(zhuǎn)錄因子，可與RNA聚合酶II （RNAPII）緊密結(jié)合，調(diào)節(jié)真核生物中信使RNA的合成。在此，結(jié)合了電子顯微鏡(EM) 和福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的混合方法(FRET) 被描述并用于定位 RNAPII-TFIIF 結(jié)構(gòu)中第二個(gè) TFIIF 亞基 (Tfg2) 的 C 末端。在第一階段，附加到 Tfg2 C 末端的多聚組氨酸標(biāo)簽用鎳-NTA 納米金進(jìn)行標(biāo)記，并設(shè)計(jì)了七步單粒子 EM 方案以獲得納米金可在 3D 中訪問的區(qū)域，表明 Tfg2 C -末端靠近RNAPII的夾子。接下來(lái)，選擇與夾子相鄰的RNAPII的Rpb2和Rpb4亞基的C端放置FRET衛(wèi)星以實(shí)現(xiàn)納米定位（NP）分析，從而提高定位精度，使得Tfg2 C發(fā)現(xiàn)-末端駐留在夾脊上，但在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可以移動(dòng)到夾頂部。因?yàn)榻邮?EM 或 FRET 探針的標(biāo)簽可以很容易地引入到任何蛋白質(zhì)亞基，這種混合方法通常適用于補(bǔ)充許多蛋白質(zhì)復(fù)合物的納米精度冷凍電鏡研究。

混合技術(shù)利用 Ni-NTA-Nanogold®

闡明亞蛋白結(jié)構(gòu)，
揭示關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制

一種新的混合技術(shù)結(jié)合了 Ni-NTA-Nanogold® 標(biāo)記、用于單顆粒分析的創(chuàng)新雙離焦成像與冷凍電鏡以及 FRET——在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)繪圖中實(shí)現(xiàn)納米級(jí)精度。該小組使用這種強(qiáng)大的方法來(lái)闡明 DNA 轉(zhuǎn)錄機(jī)制關(guān)鍵組件的結(jié)構(gòu)和功能，甚至揭示了這些部分在與 DNA 相互作用以物理啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)的運(yùn)動(dòng)。